2 DMN（二甲基亞硝胺）誘導C57小鼠肝纖維化模型建立

2.1 原理  

二甲基亞硝胺（DMN）通過肝臟代謝生成甲基自由基，直接損傷肝細胞及肝竇內皮細胞，激活炎癥反應（TNF-α、IL-6釋放）和肝星狀細胞（HSC）活化，促進膠原蛋白（Ⅰ/Ⅲ型）異常沉積，最終形成肝纖維化。其機制不依賴致癌性基因突變，而通過氧化應激與ECM代謝失衡驅動纖維化進程。

2.2 實驗步驟  

2.2.1 動物準備

• 品系選擇：雄性C57BL/6J小鼠（6-8周齡），雄性對DMN肝毒性更敏感。

• 環(huán)境適應：SPF級環(huán)境中適應1周，自由攝食飲水，維持12小時光/暗周期。

2.2.2 DMN給藥方案

纖維化誘導方案：

• 劑量：DMN 1mg/ml（溶于生理鹽水，避光保存，現(xiàn)用現(xiàn)配）。  

• 注射方式：每日固定時間1次腹腔注射，每周隔天注射共3天，隨后停藥4天（每周為1個循環(huán)）。  

• 總周期：4周（共12次注射）。  

關鍵注意：

• 注射時避免漏液（易致腹膜炎癥）。

• 每周監(jiān)測體重，存活率需＞80%（劑量過高易致死）。  

2.2.3 實驗周期

• 急性損傷期：注射后1-2周，肝細胞壞死與炎癥浸潤顯著。

• 纖維化形成期：注射后3-4周，門靜脈周圍膠原沉積，橋接纖維間隔形成。

2.3 模型驗證方法  

2.3.1 生化指標檢測

• 血清肝功能：ALT、AST水平升高2-3倍（ELISA法）。

• 肝纖維化標志物：羥脯氨酸（Hyp）含量增加＞50%（比色法）。

2.3.2 病理學分析

1. 大體觀察：肝臟表面粗糙，可見灰白色纖維條索（圖1）。

2. 組織切片：

• H&E染色：肝細胞壞死、炎性細胞浸潤及纖維間隔形成。

• 天狼星紅染色：膠原沉積面積定量（紅色區(qū)域占比≥15%）。

• 免疫組化：α-SMA（活化的HSC標志物）陽性率＞30%。

2.3.3 分子標志物檢測

• Western blot：TGF-β、CollagenⅠ蛋白表達顯著上調。

• qPCR：MMP-2/9下調，TIMP-1上調，提示ECM降解受阻。

總結

DMN通過氧化損傷→炎癥→HSC活化→膠原沉積的級聯(lián)反應誘導肝纖維化，模型穩(wěn)定且重復性高，需結合多維度指標（生化、病理、分子）驗證，適用于抗纖維化機制與藥物研究

2.4 關鍵注意事項

2.4.1 劑量控制

DMN劑量>15 mg/kg可能導致急性肝壞死（圖二），<5 mg/kg則肝損傷發(fā)生率低。

2.4.2 品系與性別差異

• C57BL/6J小鼠對DMN敏感性低于其他品系（如B6C3F1），需延長誘導周期。  

• 雌性小鼠因雌激素保護作用，肝纖維化發(fā)生率顯著低于雄性。  

2.4.3 倫理與動物福利

• 每周監(jiān)測體重、活動度及毛發(fā)狀態(tài)。  

• 肝損傷體積>2000 mm3或體重下降≥20%時，使其優(yōu)逝。

安培生物致力成為推動生命科學進步值得信賴的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術實力、先進的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)?？偛吭O在廣東，服務面向全國。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術服務與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學的發(fā)展提供較好的產品與服務。本公司建立了涵蓋分子生物學、細胞生物學、免疫學、信號傳導和神經(jīng)科學等領域的產品供應線，在各個領域內向用戶提供較高的水平和質量穩(wěn)定的產品，安培生物致力于為廣大的科研機構、高等院校等客戶提供各種產品、技術支持與服務?？梢栽诘谝粫r間為用戶提供比較先進的專業(yè)資訊和完備的產品和物流服務。 專業(yè)的技術力量使得我們能夠為廣大用戶提供強大的技術支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進的高科技產品推薦給國內從事生物學領域科研的老師和同仁。作為專業(yè)性的產品供應商，公司出資存?zhèn)淞舜罅楷F(xiàn)貨，配合優(yōu)秀的銷售隊伍以及專業(yè)的技術支持，隨時為客戶提供服務