在生物醫(yī)學(xué)實驗中，細(xì)胞培養(yǎng)是基礎(chǔ)中的基礎(chǔ)，大部分實驗只需要用到相關(guān)細(xì)胞系的培養(yǎng)，但對實驗動物原代細(xì)胞的培養(yǎng)也是非常重要的。脾臟T細(xì)胞的分離和培養(yǎng)就是免疫學(xué)領(lǐng)域的一種非常基礎(chǔ)和重要實驗方法。本文將詳細(xì)探討小鼠脾臟T細(xì)胞分離培養(yǎng)的關(guān)鍵步驟，幫助大家更有效地進(jìn)行實驗操作。

一、實驗?zāi)康?/span>

提取小鼠脾臟的naive CD4+ T細(xì)胞，研究某種因素對naive CD4+ T細(xì)胞或某一亞型的CD4+ T細(xì)胞增殖分化和功能狀態(tài)的影響，或者在誘導(dǎo)分化為CD4+ T細(xì)胞的某一亞型后做下游實驗。

二、實驗內(nèi)容

小鼠脾臟naive CD4+ T細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)

三、實驗條件

動物房超凈臺、細(xì)胞房超凈臺

四、實驗設(shè)計原理和方法

原代細(xì)胞的培養(yǎng)實驗中，無菌分選是關(guān)鍵。磁珠分選（MACS）和流式分選（FACS）是最經(jīng)常使用的兩種分離特定細(xì)胞的方法。

流式分選可以有以下特點：

1.實現(xiàn)單個細(xì)胞的分選

2.同時分選多種細(xì)胞

3.可以基于細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)水平進(jìn)行分選

4.可以基于細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物進(jìn)行分選

5.可以分選由多個標(biāo)志物復(fù)雜組合的細(xì)胞類型

磁珠分選是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗結(jié)合，在外界磁場中與抗體結(jié)合的細(xì)胞被吸附而滯留在分選柱內(nèi)，而缺乏該表面抗原的細(xì)胞則不能在分選柱內(nèi)停留。分為陽性分選（磁珠結(jié)合的細(xì)胞是目的細(xì)胞）和陰性分選（磁珠結(jié)合的細(xì)胞是非目的細(xì)胞）兩種分選策略。

與流式分選相比，磁珠分選更簡便更快捷，是分離常見細(xì)胞類型的第一選擇。在樣本量較大或分選稀有細(xì)胞類型時，先磁珠分選后流式分選的方案能夠顯著提高分選的效率。

五、實驗材料

（一）10cm培養(yǎng)皿、PBS、75%酒精、24孔板、手術(shù)器械（兩套）

（二）STEMCELL磁珠分選儀器、磁珠分選磁力架、分選柱、70um細(xì)胞濾網(wǎng)、裂紅液

六、實驗步驟

（一）取脾（動物房超凈臺）

1.將小鼠脫頸處死，用75%酒精浸泡一分鐘后放入10cm培養(yǎng)皿中準(zhǔn)備解剖，使用不同的小鼠品系可能會影響產(chǎn)量和性能。例如，來自C57BL/6小鼠的細(xì)胞更好地產(chǎn)生Th1細(xì)胞，而來自Balb.c小鼠的細(xì)胞更好地產(chǎn)生Th2細(xì)胞。；

2.第一套器械用于剪開分離皮膚肌肉，暴露出足夠的視野時，換用第二套器械用于取脾。之后處理每一只小鼠時，第一套和第二套器械都不要混用；

3.取出的脾放入裝著PBS的24孔板中。

（二）制備單細(xì)胞懸液（細(xì)胞房超凈臺）

1.將脾臟放在70um細(xì)胞濾網(wǎng)上，研磨并加入5ml PBS（一個脾臟用5ml）過濾，過濾至15ml/50ml離心管中，這一步建議過濾兩次，否則會在后續(xù)離心時形成富含纖維的沉淀，棄置此沉淀又會浪費很多細(xì)胞；

2.600g離心5min，棄上清。每個脾臟5ml/10ml裂紅液重懸，室溫裂紅5min，加入2ml/4ml PBS（與裂紅液體積對應(yīng)）終止；

3.600g離心5min，棄上清。每管脾臟取1-2ml PBS重懸，從中取出100ul依次稀釋成10倍和100倍；

4.從10倍和100倍稀釋液中取出10ul放入細(xì)胞計數(shù)板，進(jìn)行計數(shù)。

（三）磁珠陽性分選（細(xì)胞房超凈臺）

磁珠分選大致分為三個步驟：潤洗（用分選buffer潤洗分選柱）、過濾（多次重復(fù)過濾細(xì)胞懸液）、洗滌（用分選buffer洗滌柱子，使細(xì)胞洗脫）。

（四）T細(xì)胞分化培養(yǎng)基制備（細(xì)胞房超凈臺）

1.磁珠分選前一天（也就是Day0）準(zhǔn)備培養(yǎng)板，加入250ul anti-mouse CD3（2 µg/mL或3 µg/mL，用PBS稀釋），37℃孵育2小時或4℃過夜包被。

2.配置T細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（50ml）：48.5ml的1640（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基、0.5ml HEPES、0.5ml GlutaMAX、0.5ml丙酮酸鈉、50ul 2-ME；

3.重懸分裝各類細(xì)胞因子，最終濃度為10ug/ml，于-20℃保存；

4.配置各種分化培養(yǎng)基（用24孔板進(jìn)行分化培養(yǎng)，每個孔加入1ml培養(yǎng)基）

（1）Th1：10ml基礎(chǔ)T細(xì)胞培養(yǎng)基，加入10ul IL-2，10ul IL-12，10.3ul IL-4抗體；

（2）Th2：10ml基礎(chǔ)T細(xì)胞培養(yǎng)基，加入10ul IL-2，10ul IL-4，11.5ul IFN抗體；

（3）Treg：10ml基礎(chǔ)T細(xì)胞培養(yǎng)基，加入10ul IL-2，10ul TGF-β；

（4）Th17：10ml基礎(chǔ)T細(xì)胞培養(yǎng)基，加入10ul IL-2，2ul TGF-β，20ul IL-6，10ul IL-1β，10.3ul IL-4抗體，11.5ul IFN抗體；

（以上培養(yǎng)基在4℃僅能保存一周）

5.每1ml細(xì)胞懸液（10^6個細(xì)胞）加入25ul CD3/CD28磁珠，振蕩混勻。不論任何分化體系都需要有CD3/CD28/IL-2的參與，這3者是T細(xì)胞增殖的基本功能抗體和細(xì)胞因子；

6.將分選出的naive CD4+ T細(xì)胞離心，按照你想要研究的亞型分成不同部分，用各自的分化培養(yǎng)基重懸，以10^6個細(xì)胞/1ml加到24孔板中培養(yǎng)

7.Day2.3 僅觀察；Day 4 直接在原孔中補(bǔ)充分化培養(yǎng)基；Day5 僅觀察；Day6 收取細(xì)胞，通過流式檢測分泌的細(xì)胞因子的水平，進(jìn)行后續(xù)實驗。

以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎點擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。

安培生物致力成為推動生命科學(xué)進(jìn)步值得信賴的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實力、先進(jìn)的經(jīng)營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業(yè)?？偛吭O(shè)在廣東，服務(wù)面向全國。安培生物集進(jìn)口試劑、實驗室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號傳導(dǎo)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應(yīng)線，在各個領(lǐng)域內(nèi)向用戶提供較高的水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機(jī)構(gòu)、高等院校等客戶提供各種產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)。

可以在第一時間為用戶提供比較先進(jìn)的專業(yè)資訊和完備的產(chǎn)品和物流服務(wù)。 專業(yè)的技術(shù)力量使得我們能夠為廣大用戶提供強(qiáng)大的技術(shù)支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進(jìn)的高科技產(chǎn)品推薦給國內(nèi)從事生物學(xué)領(lǐng)域科研的老師和同仁。作為專業(yè)性的產(chǎn)品供應(yīng)商，公司出資存?zhèn)淞舜罅楷F(xiàn)貨，配合優(yōu)秀的銷售隊伍以及專業(yè)的技術(shù)支持，隨時為客戶提供服務(wù)。