1. 用胰蛋白酶消化后，將細(xì)胞懸浮，計(jì)數(shù)細(xì)胞，用 2 L 培養(yǎng)液將懸液稀釋至細(xì)胞密度為 2x104 個(gè)/ml。

2. 使小室長(zhǎng)邊朝下，放置，將培養(yǎng)液供應(yīng)管與 Luer 連接管相接，再通過(guò)供應(yīng)管與底孔連通。

3. 經(jīng)供應(yīng)管加入細(xì)胞和培養(yǎng)液。所有培養(yǎng)小室內(nèi)的液體將達(dá)到相同水平。

4. 按單層細(xì)胞平面將小室轉(zhuǎn)動(dòng) 90度，使單元的短邊朝下，放置，使進(jìn)孔和供應(yīng)管朝上。

5. 在 Luer 連接管處，中斷供應(yīng)管與培養(yǎng)液儲(chǔ)存器的連接。

6. 與細(xì)胞單層平面垂直，將培養(yǎng)小室轉(zhuǎn)動(dòng) 90度，以底部放平，使培養(yǎng)面呈水平位。

7. 用 5% CO2 空氣向單元充氣 5 min，然后夾住供應(yīng)管和出口。如果需要，可連續(xù)充氣。

8. 倒掉供應(yīng)管和出口內(nèi)的培養(yǎng)液，然后將單元移入培養(yǎng)箱。

9. 更換培養(yǎng)液（或收集培養(yǎng)液）時(shí)，按步驟 6 的相反程序操作。除去輸入管上的濾器，然后按步驟 4 相反程序操作。

10. 擦洗 Luer 連接管，松開(kāi)夾具，使培養(yǎng)液流出。

11. 按步驟 2~8 更換培養(yǎng)液。

12. 收集細(xì)胞。

(a)按步驟 9 和步驟 10 除去培養(yǎng)液。

(b)加入 500 ml D-PBSA，然后除去。

(c)加入 4℃的 500 ml 胰蛋白酶，30 s 后除去。

(d)用剩余的胰蛋白酶將細(xì)胞消化 15 min。

(e)加入培養(yǎng)液，搖動(dòng)培養(yǎng)小室，使細(xì)胞懸浮。

(f)按步驟 9 和步驟 10 取出含細(xì)胞的培養(yǎng)液。

13. 殘留細(xì)胞可用于接種下一批細(xì)胞，雖然這種方法難以控制接種密度。最好是將培養(yǎng)小室丟棄，用新的小室重新開(kāi)始培養(yǎng)。

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