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    細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)原理及應(yīng)用(瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染)

    發(fā)布時間: 2022-03-14  點擊次數(shù): 2534次

    常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類,一類是瞬時轉(zhuǎn)染,一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(永(jiu)轉(zhuǎn)染)。前者外源DNA/RNA 不整合到宿主 染色體中,因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數(shù),產(chǎn)生高水平的表達,但通常只持續(xù)幾天,多用于啟動子和其它 調(diào)控元件的分析。

    一般來說,超螺旋質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)染效率較高,在轉(zhuǎn)染后24-72 小時內(nèi)(依賴于各種不同的構(gòu)建)分 析結(jié)果,常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白,β 半乳糖苷酶等來幫助檢測。后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,外源DNA 既可以整 合到宿主染色體中,也可能作為一種游離體(episome)存在。

    盡管線性DNA 比超螺旋DNA 轉(zhuǎn)入量低但整合率高。 外源DNA 整合到染色體中概率很小,大約1/104 轉(zhuǎn)染細胞能整合,通常需要通過一些選擇性標(biāo)記,如來氨丙基轉(zhuǎn)移 酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B 磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反復(fù)篩選,得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細 胞系。

    轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大,許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA 與轉(zhuǎn)染 試劑 比例,細胞數(shù)量,培養(yǎng)及檢測 時間等。一些傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染技術(shù),如DEAE 右旋糖苷法,磷酸鈣法,電穿孔法,脂質(zhì)體法各有利弊,其主要原理及應(yīng) 用特點見下表:

    (各種轉(zhuǎn)染方法的比較) 除上述傳統(tǒng)方法外,近年來國際上推出了一些陽離子聚合物基因轉(zhuǎn)染技術(shù),以其適用宿主范圍廣,操作簡便對 細胞毒性小,轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們的青睞。其中樹枝狀聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亞胺(Polyethylenimine, PEI)的轉(zhuǎn)染性能最佳,但樹枝狀聚合物的結(jié)構(gòu)不易于進一步改性,且其合成工藝復(fù)雜。

    聚乙烯亞胺是一種具有較 高的陽離子電荷密度的有機大分子,每相隔二個碳個原子,即每“第三個原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子,使得聚合 物網(wǎng)絡(luò)在任何pH 下都能充當(dāng)有效的“質(zhì)子海綿"(proton sponge)體。這種聚陽離子能將各種報告基因轉(zhuǎn)入各種種 屬細胞,其效果好于脂質(zhì)聚酰胺,經(jīng)進一步的改性后,其轉(zhuǎn)染性能好于樹枝狀聚合物,而且它的細胞毒性低。大量 實驗證明,PEI 是非常有希望的基因治療載體。

    目前在設(shè)計更復(fù)雜的基因載體時,PEI 經(jīng)常做為核心組成成分。線 型PEI(Line PEI,LPEI)與其衍生物用作基因轉(zhuǎn)染載體的研究比分枝狀PEI(Branched PEI,BPEI)要早一些,過 去的研究認為在不考慮具體條件,LPEI/DNA 轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細胞毒性較低,有利于細胞定位,因此與BPEI 相比應(yīng)該 轉(zhuǎn)染效率高一些。

    但最近研究表明BPEI 的分枝度高有利于形成小的轉(zhuǎn)染復(fù)合物,從而提高轉(zhuǎn)染效率,但同時細胞 毒性也增大。超高分枝的、較柔性的PEI 衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基,在染實驗中發(fā)現(xiàn)這種PEI 的毒性低, 但轉(zhuǎn)染效率卻較高。



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